Aβ蛋白注射致癡呆模型構建

一、模型構建的核心機制

Aβ蛋白注射模型基于淀粉樣蛋白級聯假說，通過外源性引入Aβ寡聚體或纖維片段模擬阿爾茨海默病（AD）的病理特征。Aβ通過以下機制誘導癡呆：

1. 神經毒性作用：Aβ寡聚體可抑制長時程增強（LTP），增強突觸長時程抑制（LTD），導致突觸功能異常。

2. 氧化應激與炎癥：Aβ激活小膠質細胞和星形膠質細胞，釋放TNF-α、IL-6等促炎因子，同時產生活性氧（ROS）破壞神經元。

3. 代謝通路干擾：Aβ通過結合APP近膜區（JM區域），改變構象多樣性，抑制α螺旋形成，促進β折疊聚集。

4. 微環境阻塞：Aβ沉積導致腦細胞間隙液流動受阻，影響代謝廢物清除及營養交換，加速神經元死亡。

二、模型構建的關鍵步驟

1. 實驗動物選擇

• 物種與品系：常用C57BL/6小鼠或Wistar大鼠，因其血腦屏障通透性適中且腦容量適合立體定位操作。

• 性別與年齡：多選用成年雌性（3-6月齡），因雌激素可能影響Aβ代謝，需通過去卵巢手術模擬絕經后狀態以增強病理表型。

2. Aβ肽制備

• 肽段選擇：優先使用Aβ1-42（毒性強于Aβ40），需通過以下步驟預聚集：

• 溶解與老化：將凍干Aβ1-42溶于六氟異丙醇（HFIP），離心去除未溶物，真空干燥后重懸于無菌生理鹽水（1 mM），37°C孵育7天形成寡聚體。

• 質量控制：通過硫黃素T熒光法或圓二色性光譜驗證β折疊結構形成。

3. 注射方式與定位

• 腦室注射（ICV）：

• 麻醉與固定：腹腔注射戊ba比妥鈉（40 mg/kg），固定于立體定位儀，保持顱骨水平。

• 定位坐標：

• 小鼠：前囟后0.8 mm，中線旁1.5 mm，深度2.5 mm（側腦室）。

• 大鼠：前囟后2.0 mm，旁開1.5 mm，深度3.0 mm。

• 注射參數：單次注射Aβ1-42（2-5 μg/μL，總劑量4-10 μg）或慢性灌注（200 ng/d，持續14天）。

• 海馬內注射：針對空間記憶損傷研究，定位海馬CA1區（前囟后3.0 mm，旁開2.0 mm，深度2.8 mm）。

4. 手術操作要點

• 微滲透泵植入：使用ALZET泵連接導管，泵體埋置于頸部皮下，導管經顱骨鉆孔固定，灌注速率0.25 μL/h。

• 感染控制：術中用慶大霉素沖洗創口，術后連續3天注射頭孢曲松（50 mg/kg）。

三、模型驗證與評估方法

1. 行為學檢測

• 新異位置識別（NORT） ：評估短期記憶，造模后實驗組對新異物體探索時間顯著減少（p<0.01）。

• Morris水迷宮：測試空間記憶，模型組逃避潛伏期延長，目標象限停留時間縮短。

• Y迷宮自發交替：反映工作記憶，AD模型組交替率低于對照（正常>70%，模型<50%）。

2. 病理學分析

• 免疫組化：抗Aβ抗體（如6E10）標記老年斑，定量海馬和皮層淀粉樣沉積面積。

• 銀染與剛果紅染色：顯示神經原纖維纏結（NFTs）及淀粉樣纖維雙折射。

• 電鏡觀察：超微結構顯示突觸前囊泡減少及線粒體腫脹。

3. 生化指標檢測

• ELISA定量：腦勻漿中Aβ42水平升高，磷酸化tau（p-tau S396/S404）增加。

• 炎癥因子檢測：ELISA或Luminex多因子檢測TNF-α、IL-1β升高。

4. 功能成像

• 微型PET/MRI：動態觀察腦葡萄糖代謝（18F-FDG攝取減少）及海馬體積wei縮。

• 磁示蹤成像：新型技術顯示細胞間隙液流動受阻，定量Aβ沉積區域擴散系數下降30%以上。

四、模型優勢與局限性

優勢：

1. 快速造模：ICV注射可在1-2周內誘導認知障礙，優于轉基因模型（需6-12月）。

2. 可控性強：可精確調控Aβ劑量與聚集狀態，適用于藥物干預時序研究。

3. 病理可逆性：通過聚焦超聲或納米紅光可清除Aβ斑塊，驗證治療策略。

局限性：

1. 非wan全病理模擬：缺乏tau病理的級聯反應，需聯合tau注射或轉基因動物。

2. 急性毒性偏差：高劑量Aβ可能引發非特異性炎癥，需設置溶媒對照組。

3. 種屬差異：嚙齒類動物Aβ代謝通路與人存在差異，需謹慎外推結論。

五、與其他AD模型的聯合應用策略

1. 雙重注射模型：ICV注射Aβ聯合側腦室注射tau蛋白（P301L突變體），模擬AD雙重病理。

2. 基因-環境交互模型：APP/PS1轉基因小鼠疊加Aβ注射，加速斑塊沉積并加重認知損傷。

3. 代謝干預模型：去卵巢大鼠+Aβ注射+高脂飲食，研究雌激素缺乏與代謝綜合征對AD的協同作用。

六、研究應用實例

1. 藥物篩選：D3肽通過結合Aβ17-26疏水區，抑制β折疊形成，減少模型小鼠海馬神經元丟失（減少40%）。

2. 機制解析：Aducanumab在ICV模型中顯示清除可溶性Aβ寡聚體，改善突觸可塑性。

3. 治療驗證：聚焦超聲聯合微泡開放血腦屏障，使模型大鼠腦內Aβ清除率提升50%，空間記憶恢復至對照水平。

七、優化方向與前沿技術

1. 靶向遞送系統：使用脂質體或外泌體包裹Aβ，提高腦內定位精度。

2. 動態監測：植入式光纖記錄系統實時監測Aβ注射后神經元鈣信號變化。

3. 類器官模型：人源iPSC誘導腦類器官+Aβ微注射，模擬AD全病理譜。