免疫熒光染色實驗

                免疫熒光染色實驗
免疫熒光是標記免疫技術發展早的一種，它是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術，通過將抗體與一些示蹤物質結合，利用抗原抗體反應進行組織或細胞內抗原物質的定位。

1、細胞固定和通透

為達到佳的檢測效果，細胞需要經過固定和通透。這些步驟非常關鍵，細胞和抗原需要佳的結構，并利于抗體與抗原結合。通常情況下，需要通過以下步驟得以實現：細胞用2%-4%多聚甲醛固定，之后用0.1%皂角苷或0.02%的Triton X-100進行通透。前者是比較溫柔的處理，但是對于核內抗原可能無效，需要用到Triton。使用皂角苷進行通透時，要注意它會引起細胞膜的可逆性通透，也就是除了在通透初期，在每個抗體孵育環節都需要進行通透。另外，細胞可以用冰甲醇進行同時固定和通透，可以避免去垢劑的使用。

2、抗體特異性

免疫熒光需要用到特異性非常強的抗體，可以避免高背景和不理想的蛋白定位結果。在大多數情況下，純化抗體的效果很好，但是正確的對照可以幫助定位抗原。使用只有二抗染色的片子作為陰性對照，有利于減少降低背景干擾。

3、合適的抗體稀釋比例

通過優化抗體稀釋比例來優化染色，通常情況下1ug/ml的純化抗體或者1:100-1:1000的抗血清足夠達到特異性染色的結果。但在能低背景染色的前提下，可以通過增加濃度來提高信號強度。如果是*次使用該抗體或測定某抗原，強烈建議濃度梯度實驗。

4、優化緩沖液和封閉劑

盡管很多抗原在常見的Buffer如PBS中可以很好的被染色，但是對于某些目的抗原，更換一下含有不同離子的緩沖液，比如鈣、鎂、鉀等，可以帶來很大程度上的改善。Rockland可提供優化過的IHC用封閉緩沖液，同樣適用于熒光染色實驗。

5、選擇正確的二抗

如果您需要做免疫實驗，我們強烈建議您選擇進行過預吸附的二抗進行單染實驗；如果是雙重甚至是多重染色，那么使用預吸附的二抗。同時，請優先選擇來自同一物種的二抗

免疫熒光染色實驗客戶提供

細胞株或細胞爬片。注：細胞爬片不宜太密；細胞固定。組織切片，一抗

公司提供

基本實驗步驟、藥品、樣品處理、圖片及圖片分析，熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡拍攝

實驗周期：1-3周