高致病性禽流感（H5N1）病毒感染模型

禽流感(avian influenza，AI)是由A型流感病毒(avian influenza viruses, AIV)引起的一種禽類的急性、高度接觸性、烈性傳染病，可引起禽類的感染或疾病綜合征。該病毒屬正黏病毒科、流感病毒屬，其含有神經(jīng)氨酸酶和血凝素，可凝集某些動物的紅細(xì)胞，對消化道、呼吸道系統(tǒng)具有致病性。雞、火雞、鴨和鵪鶉等家禽及野鳥、水禽、海鳥等均可感染，而家養(yǎng)的雞和火雞引起的危害為嚴(yán)重，國外報(bào)道，已發(fā)現(xiàn)帶毒鳥類達(dá)88種。根據(jù)其對易感雞致病性強(qiáng)弱，可將禽流感病毒分為高致病性AIV(如H5N1等)和低致病性AIV(如 H9N2等)。火雞、雞、鴨和鵝自然狀態(tài)下容易感染禽流感病毒，是常用的實(shí)驗(yàn)動物。其他可用作AIV人工接種的實(shí)驗(yàn)動物有：雪貂、貓、倉鼠、小鼠、猴、水貂及豬。

1 嚙齒類動物模型

(1)復(fù)制方法  4～6周齡SPF級ICR小鼠或NIH小鼠。首先將病毒無菌接種于10日齡雞胚的尿囊腔，病毒毒株為A/Goose/Guangdong/NH/2003(H5N1)，待活化增殖后，病毒的血凝滴度可達(dá)到1：256。將小鼠麻醉后，經(jīng)其鼻腔接種AIV，接種量為0.1ml/只，然后通過模型動物體溫、體重、臨床癥狀、病理變化、病毒分離和抗體測定進(jìn)行比較分析。接種后ICR及NIH小鼠的肺臟肉眼可見，充血和水腫，肺體積變大，肺組織表面局部有輕度實(shí)變，呈現(xiàn)斑點(diǎn)狀充血；鏡下病理組織學(xué)觀察可見，肺間質(zhì)充血，血管周圍有炎癥細(xì)胞浸潤；細(xì)支氣管內(nèi)充血，部分管壁黏膜上皮細(xì)胞壞死、脫落。

(2)模型特點(diǎn)  機(jī)體呼吸道是AIV病毒的主要感染途徑，敏感動物可出現(xiàn)支氣管和肺組織內(nèi)明顯病理變化；部分動物尚可出現(xiàn)體液免疫反應(yīng)，有接近1/2的感染小鼠可檢測到AIV抗體，且出現(xiàn)抗體的時(shí)間為接種后第6日。部分動物體內(nèi)有病毒復(fù)制，大部分ICR和NIH模型小鼠分離到AIV，ICR和NIH小鼠對AIV敏感，較適宜作為AIV小動物模型。

(3)比較醫(yī)學(xué)  接種感染后ICR小鼠和NIH小鼠均出現(xiàn)較為明顯的臨床癥狀，表現(xiàn)為反應(yīng)遲鈍、食欲減退、呼吸急促，出現(xiàn)皺毛、弓背等現(xiàn)象，并日益嚴(yán)重；體重與體溫均呈降低趨勢，其臨床癥狀及病理變化比較典型。而人感染禽流感病毒后的主要癥狀表現(xiàn)為發(fā)熱，體溫大多持續(xù)在39℃以上，可伴有鼻塞、咳嗽、咽痛、頭痛、肌肉酸痛和全身不適。在實(shí)驗(yàn)過程中近半數(shù)接毒小鼠死亡。模型動物臨床癥狀和人的臨床癥狀并不*相同，但組織病理變化基本相似。到目前為止，人工感染途徑主要有鼻腔、氣管、結(jié)膜、皮下、肌肉等，模型動物的發(fā)病率和臨床癥狀受多種因素(動物易感性、病毒毒力、接種途徑和動物年齡等)的影響。

2 非人靈長類動物模型

(1)復(fù)制方法  采用“環(huán)甲膜穿刺術(shù)”接種病毒。恒河猴取仰臥位，頭盡量后仰，在甲狀軟骨與環(huán)狀軟骨之間確定環(huán)甲膜的位置；在鎖骨中線處，與皮膚成35°～45°角向足部方向進(jìn)針，可用16號注射針頭刺向環(huán)甲膜進(jìn)入氣管腔，經(jīng)氣管注射雞胚培養(yǎng)的禽流感H5N1病毒(病毒血凝滴度達(dá)1：256以上，毒株為ACGoose/Guangdong/11961H5N1)感染恒河猴，觀察恒河猴染毒后出現(xiàn)的臨床體征，用顯微計(jì)數(shù)法檢測外周血白細(xì)胞的動態(tài)變化，用ELISA檢測禽流感病毒特異性抗體變化規(guī)律，用流式細(xì)胞儀檢測外周血T淋巴細(xì)胞及其亞群的動態(tài)變化。模型動物以肺部損傷為主，伴多器官病變。肺部的病變主要表現(xiàn)為彌漫性肺泡損傷，先后經(jīng)歷滲出期、增生期和纖維化期；在肝臟、腎臟和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中也觀察到變性、壞死等病理變化。

(2)模型特點(diǎn)  接種病毒后動物急性發(fā)病，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱，呼吸困難，精神萎靡，活動減少，食欲下降，并有咳嗽和紫紺等，肺部聽診模型動物雙肺可聞及干、濕音。鏡下病理組織學(xué)觀察以肺病理損傷變化為主，伴多器官病變；肺組織病變主要表現(xiàn)為彌漫性肺泡損傷，可先后出現(xiàn)滲出期、增生期和纖維化期；在肝臟、腎臟和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中也可見變性、壞死等病理變化。病毒僅在模型動物的呼吸系統(tǒng)中復(fù)制，不在呼吸道以外的組織器官中復(fù)制；肺內(nèi)支氣管上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞和肺巨噬細(xì)胞是禽流感病毒侵犯的主要細(xì)胞類型。接種感染早期，模型動物外周血白細(xì)胞總數(shù)、淋巴細(xì)胞數(shù)可出現(xiàn)短暫的下降，而中性粒細(xì)胞數(shù)則先升后降，但均于感染第7日后逐漸恢復(fù)至正常水平。感染后第7～11日，機(jī)體抗體水平可持續(xù)快速升高；感染第11日后，抗體水平呈漸進(jìn)性緩慢升高趨勢(觀察到染毒后50d為止)。感染后模型動物機(jī)體細(xì)胞免疫功能受損，表現(xiàn)為CD3+T淋巴細(xì)胞、 CD3+ CD4+ T淋巴細(xì)胞和CD3+ CD8+ T淋巴細(xì)胞均出現(xiàn)短暫的下降，但這種細(xì)胞免疫功能受損是可逆的，至感染第7日后可逐漸恢復(fù)回升正常。

(3)比較醫(yī)學(xué)  恒河猴感染后的臨床特點(diǎn)、病理變化、外周血象、免疫反應(yīng)等均與人禽流感嚴(yán)重病例相似，其表現(xiàn)的臨床癥狀和肺組織病理變化比NIH小鼠模型和ICR小鼠模型更為典型，可為人類禽流感病毒感染的致病機(jī)制、藥物治療以及疫苗評價(jià)提供近似于人類的動物模型。