科研中的miRNA研究方法總結

                    科研中的miRNA研究方法總結    

microRNA(miRNA) 是一類長度在22nt左右的內源非編碼小RNA，廣泛存在于動物、植物、病毒等多種有機體中。1993年，Lee等人在秀麗新小桿線蟲(C.elegans)中發現了控制著線蟲時序性發育的lin-4。2000年，Reinhart等發現了另一個具有轉錄后調節功能的小分子RNA：let-7。隨后的幾年時間里，許多研究人員相繼發現了這類RNA，并將這些具有時空表達特異性的非編碼小分子RNA命名為microRNA(miRNA)。  

從長的初級miRNA(pri-miRNA)到形成成熟的單鏈miRNA到與靶標RNA結合，至少需要四步：先是由核糖核酸酶ⅢDrosha和DGCR8組成的復合物將初始miRNA 轉錄本（pri-miRNA）加工成miRNA前體（pre-miRNA）；接著由轉運蛋白Exportin-5和Ran GTP酶將miRNA從細胞核轉運到細胞質中；第三步是由另一種核糖核酸酶ⅢDrosha將miRNA前體剪切成成熟的miRNA雙鏈，miRNA雙鏈打開，其中一條進入到RNA誘導的沉默RISC復合體（RISC）中，該復合體還包含TarRNA結合蛋白（TRBP）；終RISC復合體根據miRNA與靶標RNA的互補配對，對靶基因進行剪切，或者翻譯抑制。

  miRNA通過作用于相應靶mRNA，參與細胞增殖、凋亡、分化、代謝、發育、腫瘤轉移等多種生物學過程。預測超過1/3的人類基因都是保守的miRNA靶基因。近些年，隨著科學研究的進展，大量的miRNA已經被鑒定出來，截至目前發現的人的成熟的miRNA有2578條，小鼠的有1908條。雖然miRNA的數量很多，但大多miRNA的功能并不為人所知。因此，準確快速地預測并鑒定miRNA的靶基因，對研究miRNA
的功能具有十分重要的意義。下面本篇文章將著重介紹一下在醫學科研領域中如何快速的鑒定與人類疾病相關的miRNA及其功能研究方法。  

一、miRNA的定量檢測  成熟miRNA的片段小，只有21bp左右，變異較大，在不同細胞中的表達差異較大，低表達的miRNA為其定量檢測帶來了很大的困難和挑戰。盡管如此，隨著科學的進步，越來越多的miRNA檢測方法被建立起來，促進了miRNA研究進展。下面介紹下在疾病研究中常用的五大miRNA定量檢測方

Northern blotting: 是較為經典的檢測各組織和器官中RNA的量和大小及估計其豐度的實驗方法。主要實驗步驟包括：①完整的RNA的分離；②根據RNA的大小通過瓊脂糖凝膠電泳對RNA進行分離；③將RNA轉移到固相支持物上，在轉移過程中，要保持RNA在凝膠中的相對分布；④將RNA固定到固體支持物上；⑤固相RNA與探針分子雜交；⑥除去非特異結合到固相支持物上的探針分子；⑦對特異結合的探針分子的圖像進行檢測、捕獲和分析。優點：高度靈敏，而且通過結合RNA marker可以檢測出miRNA的片段大小，能夠排除實驗被其他小分子RNA污染的可能性性，但Northern blotting對樣品的需求量較高，操作步驟繁瑣，不適用高通量分析。  微陣列芯片技術（microarry）：也稱生物芯片、DNA芯片或者基因芯片技術，是一種平面的基質載體，上面規則地、特異性地吸附著基因或基因的產物。當與熒光標記過的樣本雜交后，相應位置熒光信號的強弱即可反映對應基因表達的豐度。其優點是能夠同時檢測多個樣本的表達量，實現miRNA的高通量分析。但芯片檢測技術對miRNA的純度質量要求較高，現行的RNA提取為了獲取高質量了RNA，往往會在純化過程丟失掉許多小分子RNA，影響一些低表達RNA的檢測。另外芯片技術的一個突出的缺點就是信息質量的穩定性和可重復性較差。這些方面都需要改進。

原位雜交：該技術可以更為直觀的顯示出miRNA的表達情況，可直接觀測到miRNA的表達時間，表達分布范圍，具體位置等，不僅可以檢測不同細胞系單個細胞中的miRNA表達，還可在不經分類和分離的情況下，比較不同細胞系中miRNA的表達水平。但miRNA分子太小，要對傳統的原位雜交技術進一步改進，增加雜交的親和性，結合牢固性，以防止洗脫過程中的丟失，造成結果不準確。  RT-PCR：與雜交方法相比，PCR方法可以高度靈敏的檢測出低表達的miRNA，并適合于高通量篩選。由于miRNA分子片段小，研究者們通過對其反轉錄引物進行特異性設計使得RT-PCR定量檢測miRNA成為可能，根據所用引物的不同可以將其分為兩大類，一類是Oligo d(T)特異的RT引物，miRNA在反轉錄前需要對其3’末端加多聚尾Poly(A)，再使用Oligo-Universal Tag通用逆轉錄引物進行逆轉錄反應，終生成miRNA對應的cDNA*鏈。莖環結構的RT引物由可以自身呈莖環狀的特異序列加上6個到8個miRNA3’端反相互補堿基組成，一條miRNA序列對應一個特異的莖環結構的反轉錄引物。兩者相比，前者引物設計容易且檢測通量高，但檢測靈敏度和特異性比后者低。熒光定量PCR根據所用熒光來源不同可以分為SYBR Green染料法和TagMan探針法。  miRNA 深度測序：該技術能夠直接對樣本中特定大小的miRNA分子進行高通量測序，可以在無需miRNA 序列信息的前提下研究miRNA的表達譜，并發現和鑒定新miRNA 分子。新一代測序常使用的3種平臺是Illumina的基因組分析儀、Roche454基因組測序儀以及 AB Life Technologies的SOLiD系統。因為miRNA的序列較短，較多應用于miRNA檢測的新一代測序技術平臺為Illumina基因組分析儀和AB Life Technologies的SOLiD系統。Illumina基因組分析儀具有所需樣品少，數據誤差小，操作流程簡單等特點。SOLiD系統的讀長為35nt，且準確度高，單次運行所得的數據量大，特別適用于miRNA的研究。而Roche454基因組測序儀測序讀長可達400~500堿基，而miRNA序列長度僅為22堿基，所以該測序儀常用于新物種的基因組測序和轉錄組測序，極少應用于miRNA測序。