RT Primer的佳選擇

通常RT primer可分為三類：oligo dT，隨機引物以及基因特異性引物。Oligo dT引物之所以應用范圍更加廣泛，是因為可由此獲得mRNA的全長拷貝。

然而如果mRNA長度過長>4kb，或者沒有polyA尾（原核mRNA或rRNA），就需要考慮使用隨機引物進行RNA的反轉錄。隨機引物雖能長基因的5’末端的轉錄，但并不能獲得整個基因全長的cDNAs，且對RNA樣品質量要求比較高，此時可用6-8個核酸聚合體來提高cDNAs的合成量。

而對于真核生物的qPCR，長隨機引物和Oligo-dT引物的混合物似乎能給出一個漂亮的結果。針對此類優化混合引物，已有兩家公司的試劑盒或可助大家一臂之力：Qiagen QuantiTect Rev. Transcription Kit和BioRad iScript Kit。

第三個選擇就是基因特異性引物，僅擴增需要的cDNA，適用于目的序列已知的情況。通常在一步RT-PCR法中可使用此類引物，因為該引物也可用作為PCR中的反向引物。

RNA的二級結構

若要獲取全長RNA的反轉錄，那么RNA二級結構的問題就不可忽略，因為反轉錄酶在遇到此類結構后會終止反應或從模板上脫落下來。

也許你很難判斷RNA是否具有二級結構，但如果基因中GC含量較高，通常意味著RNA很難被變性且不可能是單鏈，此時就需要在65℃ 5min對其進行充分變性，以避免其對實驗結果的影響。

另外，還有一種方法可解決此問題，即使用一種適溫度高于正常標準（37℃-42℃）的逆轉錄酶。比如來自Life Technologies的Themoscript酶就常用于具有復雜結構RNA的逆轉錄。當然也存在一些即使在常規逆轉錄溫度（37℃-42℃）的條件下，也能跨過RNA二級結構的率逆轉錄酶，即使是針對富集GC序列的RNA也能得到很好的結果，如Qiagen公司的逆轉錄酶Omniscript和Sensiscript，以及Takara Bio公司的PrimeScirpt RT enzyme。

去除gDNA

RNA中存在的基因組DNA（gDNA）污染可能是終PCR反應中假陽性結果出現的原因，目前已存在很多方法去除gDNA，比如通過DNAase對提取的RNA進行預處理。

以上方法無可避免會造成RNA的蛋白污染，因而這里介紹一種可繞開酶處理的方法，即針對RNA設計一種包含內含子或內含子-外顯子邊界的引物，如此DNA就不會產生擴增抑或即便擴增了其條帶大小也與cDNA不同。

但值得注意的是，使用該方法時基因中要沒有假基因存在，假基因（pseudogene）是插入到基因組中剪切mRNA的DNA拷貝，否則也會產生假陽性結果。

而對于沒有內含子的原核RNA，gDNA的去除則更是基因表達準確測量的一個至關重要的因素。使用DNAase處理RNA是*的方法，Quantitect Rev.Transcription Kit中所包含的gDNA清除緩沖液就可在無需加熱或EDTA失活的條件下降解DNA。此外，具有gDNA Eraser（Takara Bio）的PrimeScript RT試劑盒也可去除gDNA，且能在不到20分鐘之內快速完成RNA的cDNA合成。

檢測RNA分子的完整性

毫無疑問，RNA質量對cDNA合成結果會產生重要的影響，而不同批次間RNA質量差異也導致RT-PCR產生不同的結果。所以在進行RT-PCR前，應該檢查RNA條帶的質量，可通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。通常完整的真核RNA應包括28S和18S RNA條帶，且較大的條帶的強度應是較小條帶的兩倍左右，另外兩個條帶強度大致相同也是可以的。

而另一種準確測量RNA質量的方法是使用Agilent BioAnalzyer儀器，它可將RNA分子可視化并能在分析RNA完整數值（RNA Integrity Number，RIN）后給出一個質量的量化標準。RIN為8-10，則表示RNA質量非常好；當RIN值低于7，則說明RNA可能有降解，可能會導致一些罕見信息的丟失等問題。RNA定量

除了掌握RNA的完整性之外，準確評估產量也很重要。產量的準確性會受到以下因素的影響：測量儀器的準確性、DNA的污染、鹽的污染以及降解程度。而為了準確測量產量，小編我更喜歡使用Nanodrop進行UV定量。

該儀器不需要稀釋樣品，并且具有非常寬的測量RNA的范圍。以小編的經驗，它可以準確讀取到10ng / ul。而傳統的紫外分光光度法應避免使用大容量的比色皿，因為這需要耗費大量的樣品。此法的缺點是也可在樣品中測量基因組DNA，如果從RNA提取過程殘留鹽或酚，則會增加吸光度，使得RNA的OD值變得更高。

而解決此問題一個方法是使用熒光染料，Ribogreen是一種RNA特異性染料，可通過熒光來測量RNA產量。現在，Nanodrop已經具備檢測Ribogreen所發出熒光的功能。

兩步法或一步法RT-PCR

RT-PCR也分兩種類型：一步法（One-step PCR）和兩步法（Two-steps PCR），具體操作見下圖。前者，RT反應和PCR擴增是在同一個反應管中進行的；而后者，RT 反應與PCR擴增反應單獨進行。

盡管這兩種方法都能得到終的結果，但是每種方法都有優缺點。選擇哪種方法取決于各種因素。如下總結它們的優缺點。

一步RT-PCR消除了樣品轉移步驟，不僅消除了控制物污染的潛在來源，而且需要較少的準備和操作時間。又因一步RT-PCR中所使用的引物是基因特異性的，靈敏度高，常用于分析低表達水平基因。而其不足在于同一樣本中只有有限數量的目的基因被擴增，且需要在轉錄和擴增間尋找一個平衡。

所以當時間對實驗很重要時，一般采用一步法，如檢測RNA病毒，也適用于高通量分析。由于該法的檢測結果準確率高，因而在需要測量表達水平上的細微差異時，也可采用此方法。

而兩步RT-PCR可將大批量的RNA轉化為cDNA，然后儲存cDNA用于后續實驗，可檢測大量基因；在分別優化RT和PCR步驟后，可更好地控制實驗過程；又因只有少量的轉錄本被用于PCR，則可能從RNA 分離到RT反應的抑制劑（如乙醇、酚及胍鹽等）都被稀釋了。

但是兩步RT-PCR更耗費時間，且帶來污染的可能性更高；RT過程應以相同效率反轉錄RNA，否則會影響qPCR的啟動效率，進而帶來不同的實驗結果，因此對于每個RT反應應使用相同的條件。

如果你需要對同一樣本的多個目標進行分析時，可選擇兩步RT-PCR。另外，當RNA的存儲是個問題時,好是進行兩步RT-PCR，因為cDNA在-20℃是穩定的。